Teknik Biakan Murni

BAB IV

TEKNIK BIAKAN MURNI

4.1         Tujuan Percobaan

˗       Untuk mendapatkan mikroorganisme yang berasal dari udara, air tanah dan telapak tangan

˗       Untuk mendapatkan kultur murni dari suspensi campuran.

4.2         Tinjauan Pustaka

Tanah merupakan media yang baik tempat tumbuh dan berkembangnya beraneka ragam mikroorganisme. Walaupun ditanah keras yang keras dan kering, mikroba bersifat dorman, yang akan tumbuh ketika ada kelembapan. Usaha untuk mengeksplorasi spesies baru mikroba dilakukan dengan penerapan teknik baru perlu dilakukan untuk meneliti meliputi kultivasi, isolasi, mikroba yang tidak dapat dikultivasi menggunakan teknik media konvensional untuk mengeksplorasi fungsi-fungsi baru mikroba tersebut termasuk metabolit sekunder atau antibiotika yang dikeluarkannya (Almunady, 2011).

Secara alami, mikrooganisme dialam ditemukan dalam populasi campuran. Hanya dalam keadaan tertentu saja populasi ini ditemukan dalam keadaan murni. Untuk dapat mempelajari sifat biakan, morfologi, dan sifat aslinya, maka mikroorganisme yang akan diteliti harus dapat dipisahkan, hal ini berarti bahwa harus diperoleh biakan murni yang hanya mengandung satu macam mikroorganisme. Untuk memperoleh biakan murni dapat dilakukan pengenceran dengan menggunakan bahan cair atau padat. Bahan padat yang ditemukan adalah agar  yang merupakan polisakarida dari rumput laut. Agar dapat mencair pada suhu 100 ^oC, sedangkan pada suhu 44 ^oC masih dalam bentuk cair. Suhu ini masih memungkinkan mikroorganisme dapat tumbuh, sehingga prinsip ini dipakai untuk mengisolasi bakteri dengan agar tuang. Pada umumnya miroorganisme tidak dapat mencerna atau mencairkan agar.

Isolasi mikroba adalah memisahkan mikroba satu dengan mikroba lain yang berasal dari campuran berbagai mikroba. Mengisolasi mikroba dengan cara menumbuhkan (menanam) dalam medium padat. Hal ini karena dalam medium padat, sel-sel mikroba akan membentuk koloni yang tetap pada tempatnya. Sel mikroba yang tertangkap pada medium padat pada beberapa tempat yang terpisah, maka sel atau kumpulan mikroba yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah (waluyo, 2008).

Biakan murni merupakan teknik yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme pada media agar memungkinkannya tumbuh dengan agak berjauhan dari sesamanya, juga memungkinkan setiap selnya berhimpun membentuk koloni.

Teknik biakan murni, Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran yang rumit ini, atau biakan campuran, menjadi spesies-spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni terdiri dari suatu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk. (Pelczar, 2008).

4.2.1. Karakteristik mikroba

a.      Aspergillus niger

  dikenal karena perannya sebagai produsen asam sitrat. Asam sitrat yang diproduksi jamur Aspergillus niger berfungsi untuk fermentasi. Organisme ini hidup pada sebuah saprobe tanah dengan beragam enzim hidrolitik dan oksidatif yang terlibat dalam pemecahan lignoselulosa tanaman, aspergillus niger dapat hidup biasanya pada suhu 35-37 ^oC dan interval pH 2,0-8,5, walaupun biasanya jamur lebih suka hidup pada kondisi asam  (Fadhila, 2013).

 

Gambar 4.1 Aspergillus Niger (Lisa M, dkk, 2015).

 

a.    Bacillus Sirculan.

Bakteri ini termasuk bakteri gram positif, katalase positif yang umum ditemukan di tanah. Bacillus Sirculan mempunyai kemampuan untuk membentuk endospora yang protektif yang memberi kemampuan bakteri tersebut mentolerir keadaan yang ekstrim. Bacillus Sirculan selnya berbentuk basil, ada yang tebal dan ada yang tipis. Biasanya berbentuk rantai atau terpisah, seperti halnya jamur jamur pada umumnya bacillus sirculan memiliki suhu optimum 25-30 ^oC dengan interval pH yang luas pH 2,0-8,5. Walaupun biasanya jamur lebih suka hidup dalam kondisi asam. (Alebouyeh M, 2011).

 

Gambar 4.2. Bacillus Sirculan (Na Logan, 1984).

 

Beberapa langkah pada pekerjaan inokulasi dan isolasi mikroba adalah:

a.    Menyiapkan ruangan

Ruang tempat inokulasi harus bersih, dan bebas angina. Dinding ruang yang basah menyebabkan butir – butir debu menempel. Pada waktu mengadakan inokulasi, baik sekali bila meja tempat inokulasi didasari dengan kain basah. Oekerjaan inokulasi dapat dilakukan didalam suatu kotak berkaca (ent-kas). Di laboratorium untuk membuat vaksin, serum, dan lain sebagainya, udara yang masuk kedalam ruangan dilewatkan saringan yang disinari dengan sinar ultra ungu.

b.    Pemindahan dengan kawat inokulasi

Ujung kawat inokulasi sebaiknya dari platina atau dari nikrom; ujung kawat boleh lurus, boleh juga berupa kolongan yang berdiameter 1-3 mm. lebih dahulu ujung kawat dipijarkan, sedang sisanya sampai tangkai cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin kembali, ujung kawat itu disentuhkan koloni. Mulut tabung tempat piaraan itu dipanasi juga setelah sumbatnya diambil. Setelah pengambilan inoculum selesai, mulut tabung dipanasi lagi kemudian disumbat seperti semula. Ujung kawat yang membawakan inoculum tersebut digesekkan pada medium baru atau pada suatu kaca benda, kalau tujuannya untuk embuat suatu sendian.

c.    Pemindahan dengan pipet

Cara ini dilakukan misalnya pada penyelidikan air minum atau penyelidikan susu. Untuk diambil 1 mL contoh (sampel) untuk diencerkan dengan 99 mL air murni yang disterilkan. Dalam pengenceran ini tergantung keadaan air atau susu yang diselidiki. Kemudian diambil 1 mL dari pengenceran ini untuk dicampur adukkan dengan medium agar-agar yang masih dalam keadaan cair. Lalu agar-agar yang masih encer dituangkan dalam cawan petri. Setelah agar membeku, maka cawan petri yang berisi piaraan baru itu disimpan ditempat yang aman, misalnya didalam incubator. Penyimpanan cawan dilakukan secara terbalik, yakni permukaan air medium menghadap kebawah; hal ini untuk mwnghindari tetes air yang kemungkinan menempel di dinding dalam tutup cawan.

d.    Inokulasi

Inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium lama ke medium yang baru. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat yang ada sangkut paut dengan medium dan pekerjaan inokulasi itu benar-benar steril; ini untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya miroorganisme yang tidak kita inginkan (dwidjisputro, 2005).

Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar.

Teknik biakan murni untuk suatu spesies dikenal dengan beberapa cara, yaitu:

1.   Cara Pengenceran

Caranya adalah dengan mengerncerkan suatu suspense yang berupa campuran bermacam-macam spesies kemudian diencerkan dalam suatu tabung tersendiri, kemudian diambil 1 mL untuk diencerkan lagi. Kemudian diambil lagi yang kedua sebanyak 1 mL untuk diencerkan lebih lanjut. Langkah selanjutnya adalah dari pengenceran ketiga diatas, diambil 0,1 mL untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni tumbuh dalam media tersebut.

2.   Cara Penuangan

Robert Koch (1843-1905) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian disebarkan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Setelah medium itu mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni-koloni yang masing-masing dapat dianggap murni

3.    Cara Penggesekan/Pengoresan

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam melakukan goresan, yaitu :

a.    Gunakan ose yang telah dingin untuk menggoreskan permukaan lempengan agar. Ose yang panas akan mematikan mikroba

b.    Sewaktu menggores, ose dibiarkan meluncur di atas permukaan lempeng

c.    Ose dipijarkan setelah menggores suatu daerah. Hal ini untuk mematikan mikroba dan mencegah pencemaran

d.    Menutup cawan petri untuk menghindari pencemaran

e.    Membalikkan lempeng untuk mencegah air kondensasi jatuh ke permukaan

Ada beberapa teknik penggesekan, yakni:

a.    Goresan T

-       Lempengan dibagi menjadi tiga bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan petri

-       Inoklasi daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung

-       Panaskan ose dan biarkan dingin kembali

-       Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan di daerah II

-       Pijarkan kembali ose dan biarkan dingin kembali

-      Prosedur di atas diulangi untuk daerah III

 

Gambar 4.3. Goresan T.

 

a.    Goresan Kuadran

Teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi menjadi 4

 

        Gambar 4.4. Goresan kuadran

a.    Goresan Radian

-       Goresan dimulai dan bagian pinggir lempengan

-       Pijarkan sengkelit dan dinginkan kembali

-       Putar lempengan agar 90^o dan buat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir lempengan

-       Putar lempengan agar 90^o dan buat goresan terputus di atas goresan sebelumnya

-     Pijarkan ose

 

Gambar 4.5. Goresan radian

a.    Goresan Sinambung

-       Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan lempengan agar

-       Jangan pijarkan ose, putar lempengan 180^o, gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar

                   Gambar 4.6. Goresan sinambung. 

1.    Cara Penyebaran (Agar sebar)

Caranya dengan memipet sebanyak 0,1 mL cairan dari botol pengencer dan biarkan cairan mengalir di atas permukaan agar. Cairan sampel disebarkan dengan penyebar yang terbuat dari gelkas. Penyebar didinginkan dahulu sebelum digunakan untuk menyebar cairan sampel pada permukaan agar. Penyebarannya dilakukan dengan memutar agar lempengan tersebut.

2.    Cara Pengucilan Satu Sel (single cell isolation)

Cara ini dengan menggunakan suau alat yang dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak bakteri, dengan tanpa ikutnya bakteri yang lain. Caranya dengan membuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kaca penutup dengan menggunakan mikropipet. Pekerjaan ini dilakukan di bawah mikroskop.

3.    Cara Inokulasi pada Hewan

Metode ini didasarkan pada kenyataan bahwa tidak semua bakteri dapat tumbuh di dalam tubuh seekor hewan (Waluyo, 2010).

Ada berbagai macam cara mengisolasi mikroba. Adapun yang perlu diperhatikan dalam mengisolasi mikroba, yakni:

-       Sifat spesies mikroba yang akan diisolasi.

-       Tempat hidup atau asal mikroba.

-       Medium untuk pertumbuhan yang sesuai.

-       Cara menanam mikroba.

-       Cara inkubasi mikroba.

-       Cara menguji bahwa mikroba yang diisolasi telah berupa biakan murni dan sesuai dengan yang dimaksud.

-       Cara memelihara agar mikroba yang telah diisolasi tetap merupakan biakan murni.

Ada beberapa cara untuk mengawetkan biakan murni agar dapat mempertahankan sifat-sifat aslinya:

-       Liofilisasi

Caranya mikroba ditanam dalam medium glukosa pepton dalam ampul-ampul. Selanjutnya didinginkan dengan dry ice pada temparatur 0 ^oC, tekanan di dalam ampul diatur sekurang-kurangnya 0,01 mmHg, lama pengeringan 12-24 jam. Setelah pengeringan ujung ampul ditutup dengan pemijaran.

-       Pengeringan perlahan

Caranya pengawetan mikroba dengan cara ini dengan melakukan hal-hal sebagai berikut:

a.    Menutup tabung biakan dengan kapas yang telah direndam dalam parafin

b.    Menutup tabung biakan dengan kertas parafin, plastik, atau sumbat karet

c.    Menutup tabung biakan dengan pemijaran seperti halnya menutup ampul

d.    Menutup permukaan biakan dengan minyak paraffin

4.2.1. Fase pertumbuhan

Mikrooganisme dapat tumbuh dan berkembang biak dengan cepat saat keadaan optimal. Pertumbuhan mikroorganisme dapat dibagi dalam beberapa fase, yaitu;

a.       fase adaptasi (lag phase) di fase ini mikroba mulai berkembang, pada fase ini perubahan bentuk dan pertumbuhn jumlh individu tak secara nyata terlihat karena fase ini dapat juga disebut sebagai fase adaptasi  

b.      fase pertumbuhan (log phase) di fase ini mikroba mulai tumbuh menjadi koloni, pada fase ini mikroba mengadakan perubahan bentuk dan meningkatkan jumah sel sehingga apabila dilihat dari kurva akan tampak meningkat.

c.       fase stasioner (stationery phase) di fase ini mikroba mengalami pengurangan sumber nutrient. Suber mikroba yang ada untuk mikrobia mengalami kehabisan atau tidak ada yang menambahi sehingga mikrobia tidak bias melakukan pertumbuhan namun juga tidak secara langsugmengalami kematian.

d.      fase kematian (death phase) di fase ini pertumbuhan mikroba akhir dari suatu jumlah individu yang kembali ke titik awal, ini disebabkan mikroba sudah tidak mampu hidup stasioner lagi.(sartono, 2014)

Karekterisasi mikroba. Untuk melakukan karakterisasi mikroba yang meliputi pengamatan tampilan koloni, sigat gram dan morfologi mikroba, maka setiap bentuk koloni yang berbeda dari biakan dalam media diamati sifat koloninya. Selanjutnya dilakukan pewarnaan untuk mengetahui sifat mikroba dan morfologi mikroba dengan pengamatan menggunakan mikroskop (komarwidjaja, 2007).